Генрих был сыном Мэтью Стюарта, 4-го графа Леннокса и Маргариты Дуглас. По отцу Генрих вёл своё происхождение от королей Шотландии из династии Стюартов, а по матери был правнуком английского короля Генриха VII Тюдора.
В юности Генрих Стюарт проживал вместе со своей матерью в Англии, но в начале 1565 г., в возрасте 19 лет, прибыл к отцу в Шотландию. Высокий, стройный и утончённый принц с первой встречи произвёл впечатление на молодую шотландскую королеву Марию Стюарт. Возможно, как полагает Стефан Цвейг, он напомнил ей изысканный французский двор, где Мария провела своё детство, и который так контрастировал с жёсткими нравами шотландской знати. Как бы то ни было, 29 июля 1565 г. состоялась свадьба королевы Шотландии и лорда Дарнли.
Этот брак, с одной стороны, вызвал резкое недовольство английской королевы Елизаветы I, которая боялась допустить соединения двух ближайших претендентов на английский престол. В отместку Елизавета арестовала мать Дарнли Маргариту Дуглас и бросила её в Тауэр. С другой стороны, поспешный брак и крах надежд на сближение с Англией привели к отставке ведущих шотландских государственных деятелей — Джеймса Стюарта, графа Морея, и Уильяма Мейтланда, до этого времени определявших политику страны. Восстание Морея, поднятое им в конце лета 1565 г., было, однако, быстро подавлено королевскими войсками.
Брак Генриха и Марии Стюарт оказался неудачным. Будучи достаточно посредственной личностью и не обладая задатками государственного мужа, лорд Дарнли, тем не менее, претендовал на первое место в королевстве. Разочарованная Мария не желала уступить своему супругу ни доли королевской власти. Постепенно королева отдалялась от мужа, всё больше полагаясь на иностранцев из своей свиты, в частности, её личного секретаря Давида Риччо. Раздражённый Дарнли сблизился с крайними протестантами во главе с графом Мортоном, недовольными продолжением католических богослужений при дворе. В результате сложился заговор против королевы. 9 марта 1566 г. заговорщики ворвались в покои Марии Стюарт и на глазах у беременной королевы зверски убили её любимца, Давида Риччо.
Несмотря на убийство, заговор в целом провалился. Мария сумела расколоть ряды заговорщиков и примирилась с супругом. В ответ граф Мортон, возмущённый предательством Дарнли, переслал королеве документы, подтверждающие причастность принца к убийству Риччо. Но даже без этих доказательств разрыв между супругами стал свершившимся фактом. Генрих поселился в Глазго и проигнорировал рождение своего сына, будущего короля Якова VI. Мария тем временем влюбилась в яркого и энергичного Джеймса Хепберна, графа Ботвелла. Появились слухи о близящемся разводе Марии и Генриха. Однако развод мог означать объявление их сына незаконным, что не могла допустить королева.
В результате, к началу 1567 г. сложилась система заговоров против Дарнли и Марии Стюарт. С одной стороны, устранение Дарнли стало главной задачей Ботвелла, стремящегося жениться на королеве. С другой стороны, после предательства своих сообщников по убийству Риччо, принц-консорт являлся врагом Мортона и крайних протестантов. К ним примыкала и группа графа Морея, которая видела в возможном убийстве Дарнли способ свержения королевы Марии. Существует также версия, что сам Дарнли планировал заговор против своей жены. Какая из этих групп в действительности организовала убийство принца, до сих пор не установлено. Известно, однако, что в ночь с 9 на 10 февраля 1567 г. взорвался начинённый пороховыми бочками дом в Керк-о’Фильде, где остановился Дарнли и где он встречался накануне с королевой. В саду при доме было найдено тело принца, по-видимому, убитого при попытке бегства из горящего дома.
Убийство Дарнли, в котором народная молва обвинила королеву, стало первым шагом к свержению в конце 1567 г. Марии Стюарт.
