Элеонора была старшей дочерью Филиппа IV, герцога Бургундского и Кастильской королевы Хуаны I. Среди её братьев и сестёр были императоры Священной Римской империи Карл V и Фердинанд I, королева-консорт Дании, Норвегии и Швеции Изабелла, королева-консорт Венгрии Мария и королева-консорт Португалии Екатерина. Ввиду болезни матери, воспитывалась вместе с братом Карлом в Нидерландах, при дворе тётки — Маргариты Австрийской.
Среди претендентов на её руку были короли Англии Генрих VII (король Англии) и Генрих VIII, короли Франции Людовик XII и Франциск I и король Польши Сигизмунд I.
По желанию брата, 16 июля 1518 она вышла замуж за короля Португалии Мануэля. У них было двое детей:
