Північно Очоа: биография

Було відомо, що ізоцітрат утворюється з цитрату за допомогою цис-аконітата, але реакція, з ?-кетоглютарату, не була доведена, тільки передбачена, і Північно вирішив приготувати передбачуваний інтермедіату «оксалосукціновую кислоту», чого він і досяг після декількох невдалих спроб. Почавши з оксалосукціновой кислоти, він спостерігав утворення ?-кетоглютарата і зробив висновок про те, що оксалосукціновая кислота дійсно є інтермедіатів даної реакції. Тим часом, біохіміки були вражені явищем фіксації CO2, що має місце в гетеротрофною бактерії, продемонстрованим Вудом і Веркманом. Північно спало на думку, що реакція ізолімонной дегідрогенази оборотна і обумовлює механізм процесу фіксації CO2 в клітинах тварин. Лабораторія Північно не була оснащена приладами, що використовують ізотопи; він вирішив, що може вивчити реакцію, яка повинна привести до окислення NADPH спектрофотометрическим шляхом, якщо ізоцітрат утворюється шляхом фіксації CO2 на ?-кетоглютарате. Однак, як він пише в «Щорічному огляді» (Annual Reviews), він не вірив, що це спрацює і відтягував експеримент до тих пір, поки не був підбадьорений Евраімом Ракера. Останній працював на факультеті мікробіології поверхом нижче, і між ними було багато дискусій. Коли, нарешті, Північно провів експеримент і побачив, як стрілка спектрофотометра прийшла в рух, показуючи окислення NADPH, він був настільки збожеволів від щастя, що вибіг і закричав: «Ідіть і подивіться, як рухається стрілка спектрофотометра!». Але, враховуючи, що було вже 9 вечора, навколо нікого не виявилося. Спектрофотометр, на якому було здійснено експеримент, був переданий в дар Американському Філософському Суспільству і повинен був бути повернутим через рік, але успіх експериментів і необхідність у спектрометрі для подальшої роботи змусила Товариство дозволити Північно зберегти прилад у себе. Після цього він стає віртуозом спектрофотометричного дослідження окисних ферментів; часто досліджувана реакція могла з'єднуватися з трьома або чотирма іншими ферментативними реакціями до тих пір, поки ланцюг не завершиться, і NAD-або NADP-залежні реакції, в яких окислялись або відновлювалися піридинові нуклеотиди, могли забезпечити основу для безперервного спектрометричного дослідження активності ферментів. Довгий час цей спектрофотометр був єдиним на всьому факультеті - успішні американські лабораторії не були настільки забезпечені, як це іноді здавалося.

У цей час у Північно був його перший дипломник, Алан Мелер, а також два аспіранти: Сантьяго Грізоліа і Артур Корнберг. Як-то раз, Алан, спостерігаючи за утворенням пірувату з малату, зауважив швидке окислення малату при додаванні NADP до екстракту голубиної печінки. Це призвело до відкриття «яблучного» ферменту - малатдегідрогенази. Фермент каталізує оборотну реакцію:

n «Яблуневий» фермент також каталізує утворення пірувату з оксалоацетата, що протікає з виділенням CO2 і відновленням малату NADPH. Це працює в окисленні жирних кислот, обумовленим коензимом А і NADPH. Вони уклали, що це - один фермент з двома активними центрами. Це нагадало їм про реакцію ізолімонной дегідрогенази і призвело до висновку, що ізолімонная дегідрогеназа, яка, як говорилося раніше, каталізує дві реакції, також має два активних центри: один для ізоцітрата, інший для окислення оксалосукціновой кислоти, і, що це не суміш двох ферментів - ізолімонной дегідрогенази і оксалосукціновой дегідрогенази - як вважалося раніше.

«Яблуневий» фермент був використаний Вольфом Вишняком і Очоа для реакції відновного карбоксилювання пірувату в малат у присутності гран шпинату і NADPH. Це була перша демонстрація фотохімічного відновлення піридинового нуклеотидів хлоропластовимі препаратами. У 1948 році Джо Штерн, колишній дипломник Ганса Кребса, в ранзі доктора наук переходить в лабораторію Північно. Очоа вирішує, що настав момент для роботи над самим цікавим ферментом циклу Кребса, над тим, який утворює цитрат з оксалоацетата і активного ацетату. Він був відомий, як «конденсується» фермент. Екстракт тканин тварин був, однак, неактивний цитратно синтезі, але вони не впадали у відчай і вірили, що таке відбувається через нерастворимости ферменту. Вони змінили бактерію, сподіваючись, що фермент розчиниться. Використовувати організми, найбільш придатні для вирішення проблеми було характерною рисою Північно. Нарешті, поєднавши екстракти кишкової палички і свинячого серця вони домагаються хорошого синтезу цитрату з ацетілфосфата і оксалоацетата у присутності каталітичних кількостей коензиму А. Як було встановлено в подальшому Ерлом Стадтманом, екстракт кишкової палички «оберігає» фермент трансацетілазу. Цей фермент каталізує перенесення ацетільной групи від ацетілфосфата до коензиму А, утворюючи ацетил CoA + PO4. Екстракт свинячого серця охороняє конденсується фермент. Вони очистили конденсується фермент до гомогенного стану і Північно, додаючи кілька крапель сульфату амонію, кристалізований його. Він був дуже гордий і сфотографував кристали. Пізніше, у спільному з Феодором Лінену дослідженні, він показав, що конденсується фермент каталізує оборотну реакцію переходу ацетил CoA і оксалоацетата в CoA + цитрат. Північно був, дійсно, дуже зайнтересован в перших стадіях окислення пірувату. У той же час, Ірвін Гонсалус проводить деякий час, працюючи за грантом, і, спільно з Сеймуром Коркесом і Еліс дель Кампілло, вивчає окислення пірувату в кишкової палички. Усвідомлюючи важливість ацетил CoA як інтермедіату у метаболізмі, лабораторія Очоа зайнялася дослідженням важливого питання про метаболізм жирних кислот. CoA-трансфераза була відкрита Джо Штерном і Мінор Куном. Джо Штерн також ідентифікував фермент кротоназу, яку кристалізували Еліс дель Компілім. Кротоназа каталізує дегідратацію ?-гідроксібутіріл CoA з утворенням кротона CoA. Кротоні CoA в подальшому перетворюється в бутіріл CoA. Цей фермент тісно пов'язаний зі з'єднанням, получающимся окисленням непарних жирних кислот і деяких амінокислот.