Екатерина была младшей дочерью Филиппа IV, герцога Бургундского и Кастильской королевы Хуаны I. Среди ее братьев и сестер были императоры Священной Римской империи Карл V и Фердинанд I, королева-консорт Португалии, а затем Франции Элеонора, королева-консорт Дании, Норвегии и Швеции Изабелла и королева-консорт Венгрии Мария.
Екатерина родилась после смерти отца, когда ее мать, и при жизни мужа бывшая не в себе, стала совершенно невменяемой. Хуана относилась к ребёнку, как к последнему, что осталось у неё от мужа. Она считала, что он говорит с ней посредством лепета младенца. Кровать девочки помещалась в алькове комнаты, попасть в который можно было лишь мимо Хуаны. Единственным развлечением ребёнка было смотреть в окно. Когда будущая королева Португалии уже девушкой была забрана оттуда ко двору в преддверии подготовки брака, все отмечали её некоторую неадекватность.
10 февраля 1525 года она вышла замуж за короля Португалии Жуана III. Родила семерых детей, из которых только двое достигли взрослого возраста:
- Афонсу (1526)
- Мария (1527—1545), первая жена короля Испании Филиппа II;
- Изабелла (1529)
- Беатриса (1530)
- Мануэль (1531—1537)
- Фелипе (1533—1539)
- Диниш (1535—1537)
- Жуан Мануэль (1537—1554), от его брака с Хуаной Австрийской родился король Себастиан
- Антонио (1539—1540).
